Ausgangssituation: Humanen Milch-Oligosacchariden (HMOs) werden verschiedene Effekte bei der Entwicklung von Neugeborenen zugeschrieben, insbesondere bei der Entwicklung des Immunsystems und des Darmmikrobioms. HMOs sollen deshalb Ersatzmilchprodukten zugegeben werden. Unter den HMOs ist das Trisaccharid 2‘-Fucosyl-Lactose (2FL) dominant. Die chemische Synthese ist aufwendig, eine biotechnologische Herstellung mittels Fermentation soll 2FL günstig, ökologisch und sicher verfügbar machen. Dabei sollen rekombinante Escherichia coli-Zellen eingesetzt werden. Erste Produktionsstämme sind verfügbar und 2FL wurde im kleinen Maßstab hergestellt.
Doktorarbeit 1:
Ziel der Doktorarbeit ist es, den biotechnologischen Prozess auszulegen und die Synthesewege zu charakterisieren. Insbesondere sollen Systembiotechnologische Methoden eingesetzt werden, um limitierende Schritte zu identifizieren und in die Stammentwicklung (in Kooperation) einfließen zu lassen. Die Arbeit besteht zu ca. 70% aus experimentellen Ansätzen und 30% Modellierungsarbeiten. Experimentell soll zunächst ein Produktionsprozess etabliert werden. Um hohe Ausbeuten zu erzielen, werden zwei Substrate eingesetzt, Glycerin und Lactose. Glycerin dient hierbei vor allem als Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum und zur Herstellung des Precursors Mannitol-6-Phosphat. Lactose wird direkt in das Produkt 2FL eingebunden. Unter den identifizierten Produktionsbedingungen werden dann Untersuchungen des Metabolismus mittels Fluss- und Metabolomanalysen durchgeführt. Zusammen mit mathematischen Modellen lassen sich dann mögliche Engpässe im Metabolismus identifizieren. Metabolite werden mittels moderner HPLC-LCMSMS Analytik identifiziert und quantifiziert.
Doktorarbeit 2:
Die niedrige enzymatische Aktivität eines der Schlüsselenzyme in der Biosynthese von 2FL stellt einen limitierenden Faktor dar. Für dieses Schlüsselenzym soll eine Strukturaufklärung erfolgen, um sie für das Design von Enzymvarianten mit höherer enzymatischer Aktivität einzusetzen. Hierbei werden verschiedene Ansätze des Protein Engineerings verfolgt. Verbesserte Enzymvarianten werden in den Prozess der Stammentwicklung eingespeist und gemeinsam mit den in Doktorarbeit 1 identifizierten Zielen für genetische Verbesserungen in neuen 2FL-Produktionsstämmen umgesetzt.